暗视野显微镜和相差显微镜的原理及其应用

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2007-09-20    阅读次数:2 来源:蔡康光学技术部

0 T: Z* T& a) z. f. x8 Q暗视野显微镜和相差显微镜的原理及其应用 1 i- c& Q8 e& T1 E & C) ^1 z# }9 i# {7 I4 R8 E3 } + o) \  Z$ @* X3 H. B$ f1．实验目的：了解暗视野显微镜、相差显微镜和荧光显微镜的工作原理和使用方法。 2．实验原理(含在实验方法中)   J8 b4 O1 F* R1 W3．实验用品 暗视野显微镜、倒置显微镜、相差显微镜、荧光显微镜（透射式和落射式）、黑纸片、剪刀、圆规、无荧光镜油、培养的活细胞、丫啶橙染色玻片标本、活细胞临时装片。 4．实验方法 4.1 暗视野显微镜 (一) 原理和结构特点 在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这是光学上的丁达尔现象。暗视野显微镜就是利用此原理设计的。它的结构特点主要是使用中央遮光板或暗视野聚光器，常用的是抛物面聚光器，使光源的中央光束被阻挡．不能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像．并非物体的本身，所以只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。但被检物体为非均质时，并大于1／2波长，则各级衍射光线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨0.004um以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜(最大的分辨力为0.2um)所不具有的特性，可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。 (二) 制作中央遮光板 $ k# V; f5 V( R: q  k: Y$ c% \普通显微镜只要聚光器是可以拆卸的，支架的口径适于安装暗视野聚光器，即可改装成暗视野显微镜。在无暗视野聚光器时，可用厚黑纸片制作一个中央遮光板，放在普通显微镜的聚光器下方的滤光片框上，也能得到暗视野效果。 , Y1 z5 a. o2 e% k9 h6 j- W(1)．将显微镜聚光器调到最高位置，用低倍镜对好焦距。 0 n0 x  Z# w6 W. H5 V9 k+ @; ^(2)．取下目镜，从镜筒中观察并调节光阑的大小，使其与镜筒中所见物镜的视野相等。 / `* c/ D( ]1 k) [! ^3 T! q(3)．用厚黑纸剪制中央挡光板。外圈直径与滤光片框架相同，中央部分的大小与调节好的光阑孔径一样(可用半透明的小纸片，放在通光孔处聚光镜镜面上，纸上显示的光斑即为光阑的孔径，再用圆规量取大小)。 (4)．将中央挡光板放在滤光片框架上，开大光阑进行样品观察。 如需使用高倍镜作暗视野观察，应按高倍镜对焦后的视野大小重新制作中央挡光板。 ; D! h, M' ]! Q保存好各自制作的中央遮光板，以便在后面的实验中使用。 2 [+ Q$ P8 s* d6 r图示中央遮光板 ! ]. @% `5 I4 o) va．光圈孔径 b．滤光片直径 ; v1 @* l7 o- C8 x. i1 s7 k + T* n* G4 \4 Y: K+ P （三）使用方法 (1)．把暗视野聚光器装在显微镜的聚光器支架上。 (2)．选用强的光源，但又要防止直射光线进入物镜，所以一般用显微镜灯照明。 (3)．在聚光器和标本片之间要加一滴香柏油，目的是不使照明光线于聚光镜上面进行全反射，达不到被检物体，而得不到暗视野照明。 ' A7 S% P5 i" _9 a7 _3 P(4)．升降集光器，将集光镜的焦点对准被检物体，即以圆锥光束的顶点照射被检物。如果聚光器能水平移动并附有中心调节装置，则应首先进行中心调节，使聚光器的光轴与显微镜的光轴严格位于一直线上。 - ~7 ^& K, T+ D1 N7 B( m(5)．选用与聚光器相应的物镜，调节焦距＜操作方法与普通显微镜相同＝，找到所需观察的物像。 4 a/ j, _. n1 t（四）观察 观察示教台上暗视野显微镜下的活细胞。在黑暗的背景里，可见细胞、细胞核和细胞器的衍射光图像。 $ b2 I) f- ]/ r- }& Q% Q# Y7 ~4.2 相差显微镜 , v4 @) x9 O! B4 r. _5 h4.2.1原理和结构特点 光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位(指在某一时间上光的波动所能达到的位置)的不同。当光通过物体时，如波长和振幅发生变化，人们的眼睛才能观察到，这就是普通显微镜下能够观察到染色标本的道理。而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部微细结构的折射率和厚度略有不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位有变化(相应发生的差异即相差)，而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相差变成振幅差(明暗差)，同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差。因此可用以观察活细胞或未染色标本。 相差显微镜(图2―3)与普通显微镜的主要不同之处是：用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜(通常标有PH的标记)代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。其作用是将直射光所形成的像从一些衍射旁像中分出来。相板安装在物镜的后焦面处，相板装有吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜。它除能推迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使亮度发生变化的作用。调轴望远镜是用来进行合铀调节的。相差显微镜在使用时，聚光镜下面环f状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上，必需调节光阑的亮环和相板的环状圈重合对齐，才能发挥相差显微镜的效能。否则直射光或衍射光的光路紊乱，应被吸收的光不能吸收，该推迟相位的光波不能推迟，就失去了相差显微镜的作用。 + h, ]  c" t8 }+ R7 H1 E' a4.2.2使用方法 相差装置为多功能系列显微镜中的附属装置．与普通显微镜配合使用。 (1)．相差装置的调换安装 卸下普通显微镜使用的聚光器，将环状光阑装在聚光器支架上，把绿色滤光片放在上面，它可吸收红色和蓝色光，使波长范围小的单色光线进行照明，并有吸热作用，能使相差观察获得良好的效果。再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。 $ F- y2 `+ @2 \+ o' U$ Z( ~- w! \. A " u$ t6 k2 M' n" s3 c(2)．调焦 打开光源，旋转集光器转盘，将“o”对准标示孔，使普通聚光器部分进入光路。先使用低倍相差物镜，按普通显微镜操作方法进行对光和调焦。 旋转环状光阑，使光阑的直径和孔宽与所使用的相差物镜相适应，如相差物镜为40 x时应用x40标示孔的光阑。 (3)．合铀调整 拔出目镜，插入合铀望远镜，一边从望远镜内内观察，并用左手固定其外筒；一边用右手转动望远镜内筒使其下降，当对准焦点就能看到环状光阑的亮环和相板的黑环，此时可将望远镜固定住。再升降集光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与黑环一致，然后左右前后调节环状光阑聚光器上的调节钮，使两环完全重合＜图2―4，如亮环比黑环小而位于内侧时，应降低集光器使亮环放大；反之，则应升高聚光器，使亮环缩小。如若升到最高限度仍不能完全重合，则可能是载玻片过厚之故，应更换。合抽调整完毕，抽出望远镜，换回目镜，按常规要领进行观察。在更换不同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹配的环状光阑和重新合抽调整。使用油镜时，集光器上透镜表面与载玻片之间要同时加上香伯泊。 4.3观察 在相差显微镜下观察活细胞，可清楚地分辨细胞的形态，细胞核、核仁以及胞质中存在的颗粒状结构。 5．实验结果 6．实验报告   W' P  U6 W5 M$ ]" D6 K! @4 h0 T附 荧光显微镜（与实验五叶绿体分离实验同时进行） + \9 \6 F  _1 l! r7 g  q! }(一)原理和结构特点 荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。 荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。荧光光源――般采用超高压汞灯(50一200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断(或压制)滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛?二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。 1 m$ C* f$ Y3 g! Q  }: y1 M荧光显微镜就其光路来分有两种： 4 b% l& k% ], H1． 透射式荧光显微镜 激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的(图2―5)。常用暗视野集光器，也可用普通集光器，调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上．这是比较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱．所以对观察较大的标本材料较好。 7 v& b5 Z  k& b, j5 t* \: N2．落射式荧光显微镜 这是近代发展起来的新式荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜(图2―6)。光路中需加上一个双色束分离器，它与光铀呈45。角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。 4 }! V3 J, h3 i0 M（二）使用方法． * O9 `; A. n( G% p6 B! Y1．打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点。 2．透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻断滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的插块。 3．用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装置，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的中央。 ) x' O8 p! i5 ?2 a2 g+ x: {$ y4．放置标本片，调焦后即可观察。 使用中应注意：末装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；用油镜观察标本时，必须用无荧光的特殊油镜；高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。 ) D1 q! `1 j9 t(三)观察 在示教台上的荧光显微镜下＜用蓝紫光滤光片＝，可见经o．01％的丫啶橙荧光染料染色的细胞，细胞核和细胞质被激发产生两种不同颜色的荧光(暗绿色和橙红色)。 ! t1 B/ z0 U" R) J, L9 q' v2 \6.实验报告 (1)制作低倍镜和高倍镜观察用的中央遮光板。 (2)为什么说倒置相差显微镜是观察培养活细胞的最有效显微镜? (3)荧光显微镜的两种滤光片各起什么作用?

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